科学家们借助高通量单细胞转录组测序技术，在发育生物学、肿瘤微环境、疾病研究等领域取得了丰硕的研究成果，揭示了单个细胞基因表达的特点，解读了细胞异质性的奥秘。随着研究的深入开展，越来越多的机制需要被揭秘，对技术的要求越来越高。为给广大科研工作者提供更好的技术服务，尊龙凯时特推出全新的解决方案 10x Flex，该技术可解锁更丰富的样本组织类型，实现更高数量级细胞的同时解析，进行更精准的胞内转录本信息锁定，现在和小编一起来了解一下这个技术吧！
01 产品概述
10x Flex（原10x Fixed RNA）使用4%的多聚甲醛（PFA）对样本进行固定，锁定细胞的瞬时表达状态。随后，运用探针杂交的方法，捕获基因，并展开建库测序和分析工作。
图1 Flex的实验流程
每个探针对都包含左臂和右臂两部分，左臂包含LHS（紫色探针）和pRead 2S结构。右臂包含RHS（黄色探针）、Constant Seq 、Probe Barcode和pCS1结构。其中pRead 2S用于连接测序仪上的flowcell，LHS和RHS用于结合靶向mRNA，Probe Barcode用于区分样本来源，pCS1用于连接Gel Beads上的Oligo序列。
图2 Flex的探针结构
02 产品优势
批次效应降低
对于获取时间不规律的肿瘤样本、发育生物学中同一来源不同时间点的样本、治疗预后相关的临床样本等场景中样本分批次采集的情况，可以应用Flex同批次进行杂交建库实验。实验梯度设置更准确，同时降低结果可变性。
瞬时表达情况锁定
对于异质性较强，生物学状态快速变化的样本，其细胞离体后，可能会受到较多外界压力和影响，Flex经过PFA及时固定，已经锁定了样本瞬时的表达状态。非常适合濒死样本、多阶段变化样本、脆弱样本、需先进行病理分型的样本等。
低表达基因检测灵敏度提升
Flex运用了探针捕获原理，人基因组pancel覆盖18,082个基因（53,444探针对），小鼠基因组pancel覆盖19,059个基因（55,128探针对）。大部分的基因设计3组探针对；对高表达的基因（7.5%），仅设计1组探针对；对部分低表达的基因，设计5组探针对。保证常规基因检出的同时提升低表达基因检测灵敏度。
采集运输难度减小
采集方面，样本的及时固定，可使取样更灵活，扩散到多个采集点的同时减少取样时间限制。运输方面，长距离运输的压力变小，也适合多中心合作的应用场景。
大规模实验成本下降
特异性的探针（Probe Barcode）高达16种，单通道最高可实现16种样本128,000个细胞的同时捕获，8通道最高可实现百万级细胞同时运行分析，大大降低实验成本。
03 样本和服务类型
尊龙凯时Flex目前可进行转录组层面的分析，由于实验运用了探针捕获原理，可接入物种仅限人和小鼠。
可接收的样本类型包括单细胞悬液、单细胞核悬液、细胞系、冻存细胞、冻存组织、血液、新鲜组织、FFPE样本，八大样本类型均可兼容。
04 数据展示
根据Flex和3’转录组的实测对比数据结果，在多个样本类型中，相同的测序数据量下，Flex所得的测序数据饱和度更高，探针灵敏度更强，单个细胞内可以检测到的基因数更多。
图3 血液样本、癌症样本、细胞系样本中Flex和3’转录组的实测对比结果
在人PMBC样本的进一步分析中，对比固定后立即运行（Day 0）、在-80°C存储1个月、在4°C存储1周，三种情况下细胞的基因表达情况。PMBC中主要细胞类群仍呈现较为稳定状态，并未伴随固定时间不同出现显著变化。
图4 三种固定条件下PBMC中主要细胞类型的比较
05 常见问题
1. Flex的测序数据量和样本注意事项？
Flex测序数据量至少为20k readspairs/cell。实际送样时，在细胞大小方面，安诺可接收常规直径≤30μm的细胞，理论支持直径≤40μm的细胞。建议老师选择来自同一组织来源的样本。需进行混样建库的样本，各样本的测序数据量保持一致。
2. Flex有没有什么特异性的应用场景？
常规3’转录组在进行解离时，可能会失去某些脆弱的细胞类型，而Flex可真实地深入研究特定的细胞类型。例如老师只想研究样本中的中性粒细胞，可通过先组织固定后进行解离的方法，拒绝组织偏好性，尽可能还原样本的原始状态。
3. Flex能不能进行细胞核层面研究？
Flex可通过样本由细胞悬浮液制备成核悬浮液的方式进行核内转录组研究。不能进行组织抽核研究。
4. 混样细胞数上升是否显著提高Flex双胞率？
Flex的捕获率和双胞率都比较稳定，细胞一个GEM携带不同来源的细胞可通过探针区分，其携带的双胞率不会随样本数而提升，捕获1,000个细胞的双胞率约为0.8%。捕获8,000个细胞的双胞率约为6.4%。
5. 分批采集的样本可以同时进行Flex实验，具体来看，样本在何种条件下怎样保存呢？
Flex固定后的样本在4℃可储存一周；在-20℃/-80℃最多可储存3个月。样本杂交后也可以在-20℃/-80℃最多储存1个月。因此，建议样本取样后先行固定，确定好最终分选建库的样本后，统一完成后续的杂交建库等工作。
